基因工程实验指导(生物技术和生物工程专业规划教材)
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内容提要：
本书以基因克隆为主线，选编了35个实验，包含了从核酸与质粒的提取、基因文库构建与筛选、基因分离方法的确定、PCR法获得基因、克隆载体和表达载体的重组、重组子的鉴定，基因的表达到表达产物——蛋白的纯化、鉴定等相关的实验技术内容。同一实验项目提供了多种可供选择的实验方法，并强调指出了实验中的注意事项，还对与实验相关的内容进行了评议。
选编的实验内容衔接紧密，在实际教学时，可以针对不同层次、不同学时数的要求，既可以集中在两个星期连续进行，也可以分成十次实验阶段性完成。为提高教学效率，作者还将实验安排分时段详细列于实验计划表中，便于教师组织实验教学。 编辑推荐：
本书是生物技术和生物工程专业规划教材。本书以基因克隆为主线，选编了35个实验，实验既重视对学生基本实验操作技能的培养和训练，又注重对学生研究能力以及分析和解决问题能力的培养，以激发学生的学习和研究兴趣。本书可为初学者提供有益的帮助，也可为科研人员提供参考。
目录：
实验计划表
导论 1 基因文库的构建 l—l 染色体DNA的提取 1—2 总RNA和mRNA的提取 1—3 噬菌体DNA的提取 l一4 染色体DNA的部分消化 1—5 基因组文库的构建 1—6 cDNA合成 1—7 cDNA文库的构建 2 目的基因的获得 2—1 PCR扩增及RT—PCR 2—2 核酸电泳 2—3 核酸探针的标记及检测 2—4 核酸探针筛选基因文库 3 载体质粒的制备 3—1 质粒DNA的提取与纯化 3—2 核酸纯度、浓度与相对分子质量的测定 4 扩增质粒的构建 4—1 限制性内切酶的酶切反应 4—2 凝胶电泳法进行DNA的分离、提纯 4—3 DNA片段的体外连接 5 重组DNA导入宿主细胞 5—1 感受态细胞的制备 5—2 重组质粒的转化 6 重组子的筛选与鉴定 6—1 阳性克隆的筛选 6—2 测序与序列同源性分析 6—3 Southern印迹 7 表达质粒的构建与诱导表达 7—1 表达质粒的构建 7—2 Northern印迹 7—3 外源基因的诱导表达 7—4 SDS—PAGE 7—5 Western印迹 7—6 酶联免疫吸附测定(ELISA) 7—7 蛋白质生物功能测定法 8 工程菌的培养与目标产物分离 8—1 发酵条件的优化 8—2 诱导表达蛋白质的分离沉淀 8—3 凝胶过滤层析 8—4 离子交换层析 8—5 蛋白质浓度的测定 8—6 酶活性的测定 8—7 分离纯化蛋白的收率计算与保存 参考文献 附录1 简写 附录2 实验注意事项 附录3 如何撰写实验报告 附录4 常用的碱基、氨基酸符号及缓冲液 附录5 大肠杆菌基因型 附录6 培养基与试剂的配制 附录7 实验仪器 书摘：
插图：
 经过PCR扩增最终获得了450 bp的DNA产物，用作探针。所以在利用蛋白质氨基酸设计寡核苷酸引物或探针时，总是选择密码简并程度最低的一段氨基酸组成的蛋白质序列，合成寡核苷酸引物或探针。有关碱基符号与氨基酸符号见附录4的表1、表2。 4）基因家族的成员大多数在进化过程中具有高度保守序列，这样就使核酸的种间杂交成为可能。即利用亲缘生物体中克隆的DNA用作异源探针。两个基因的同源性越高，成功的可能性就越大。如用水稻的几丁质酶基因作为探针分离得到了豆类植物的同源基因。一般探针与目的基因的同源性大于80％，就能通过杂交较为顺利地找到目的基因。此外，这种方法的筛选过程中，杂交的条件应适当放宽（降低复性温度）。即利用亲缘生物体中克隆的DNA用作异源探针，这种情况的杂交条件应该调整到允许一定程度的探针与目标DNA之间的错配，以补偿这两种的序列之间存在的差异。 3.通过免疫反应进行基因文库的筛选 如果没有DNA探针，可以应用蛋白质抗原抗体反应的方法筛选文库。如果目的基因可以转录和翻译，只要出现目的基因的蛋白质，甚至是蛋白质的一部分，且目的基因所编码的蛋白质易于提取，即可利用此蛋白质作为抗原，制备出该抗原的抗体。并选用表达型载体分子，构建的cDNA文库进行筛选。由于插入的基因可与大肠杆菌中的基因相融合，并进行诱导表达，当抗体分子识别出表达相应抗原的克隆时，即找到含有目的基因的重组DNA分子。 4.通过酶活性筛选（应用表达文库） 如果目的基因编码一种酶，而这种酶又是宿主细胞不能编码的，那就可以通过检查酶活性存在与否来筛选目的基因。如多种生物体中编码的a一淀粉酶、葡聚糖内切酶和卢一葡糖苷酶的基因就是通过这种方法分离出来的，即先把基因文库转入一选择性菌株，涂布在带有一定特定底物的培养基上培养，筛选那些可以利用这种底物的克隆。如果要寻找的基因所编码的蛋白对突变的宿主菌细胞的生长极为重要的话，那么将基因文库导入这些突变的细胞以后，那些能在不含所需底物的基本培养基上生长的细胞中必定就带有一个具功能的目的基因。运用这种遗传互补的方法已经分离出许多具有重要功能的基因，包括那些与抗生素生物合成相关的与某些植物的根上形成固氮根瘤相关的基因。 5.差示杂交法（differential hybridization） 适用于某些组织特异性或时序特异性表达的基因的筛选的一种方法。特别适合于分离特定组织中 …… |