生物化学与分子生物学实验指导
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内容提要：
本教材按162学时编写，总共分为七大部分，实验分上下学期完成，本学期完成生物化学部分，下学期完成分子生物学部分。希望通过本教材的指导，同学们能够顺利完成分子生物学部然。希望通过本教材的指导，同学们能够顺利完成生物化学与分子生物学实验，并了解现代生物学与分子生物学实验最基本的技术。并在今后专业课程的学习和将来的工作中能灵活应用。本教材所涉及的技术面比较广泛。可供理科、农林类及医学各科学生参考使用。
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目录：
第一部分 生物化学与分子生物学实验放门
一、实验室规则 （一）实验室安全规则 （二）实验室卫生规则 （三）学生守则 二、常用仪器的使用方法 （一）722型分光光度计 （二）752型紫外可见分光光度计 （三）离心机 （四）微量移液器 （五）电子天平 （六）Elx酶标仪 （七）Pct-100pcr仪 三、器皿的洗 涤及要求 （一）一般实验要求 （二）分子生物学实验要求 四、实验结果的记录及保存 五、实验报告的完成 六、实验成绩评分方法 第二部分 生物大分子的制备及鉴定实验 实验一 蛋白质的盐析分极分离及凝胶层析脱盐 实验二 凝胶过滤层析法测定蛋白质的分子量 实验三 醋酸橇维素膜电泳分离鉴定蛋白质 实验四 蛋白质含量的测定 实验五 琼脂糖凝胶电泳分离乳酸脱胶电泳 实验六 常规蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验七 蛋白质的双向电泳 实验八 丹磺酰化法分析蛋白蛋N-末端氨基酸 实验九 动物基因缚DNA的分离纯化 实验十 核酸的定量测定 实验十一 SNA 的Tm值测定 实验十二 植物总TMA的提取 实验十三 甲醛变性凝胶电泳的鉴定RMA 实验十四 离子交换柱层析分离核苷酸 第三部分 酶动力学测定实验 实验一 酵母蔗糖的制备 实验二 DEAE纤维素柱层析纯化酶蛋白 实验三 各级分蔗糖酶活性测定及纯化率的计算 实验四 底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数Km和最大反应速度Vmax的测定 实验五 反应时间对产物形成的影响 实验六 pH值、温度、抑制剂对蔗糖酶活性的影响 第四部分 免疫化学检测实验 实验一 免疫血清的制备 实验二 双向免疫扩散法测定抗血清效价 …… 第五部分 分子生物学实验 第六部分 开放及综合设计性实验 附录 书摘：
2．蛋白质N末端氨基酸的DNS化
取0．5mg蛋白质样品，置于有塞玻璃管中。用少量水溶解后，加入0．5m10．2mol/L碳酸氢钠溶液。再加入0．5mlDNS-CI丙酮溶液，用三乙胺调至pH9，0-9，5，塞好塞子，于40℃烘箱中反应2h，或室温(25℃左右)放置2—4h，生成DNS-蛋白质。 3．DNS蛋白质的水解 DNS化反应结束后。真空蒸去丙酮，加入0．5ml 6mol几盐酸溶解DNS-蛋白质。全部移入水解管。抽真空封管，于111℃烘箱中水解18-24h。开管后蒸去盐酸，加少量水，再蒸干。重复2—3次以除尽盐酸。 4．DNS一氨基酸的抽提 将上述水解产物，加O．5ml水，用1mol几盐酸调至pH2—3加入0．5ml乙酸乙酯抽提，分层可在细长滴管中进行。重复抽提2—3次，将上层抽提液合并于小试管中，抽去乙酸乙酯，置于干燥器中备用。 5．DNS-氨基酸的层析与检测 生成的DNS-氨基酸和标准DNS-氨基酸分别进行聚酰胺薄膜层析。 (1)聚酰胺薄膜的准备 将聚酰胺薄膜剪成7cm×7cm的方块，在距边0．5cm处画互为垂直的两条基线，交叉点为原点。若只做单相层析，则只画一条基线，在基线上每隔1cm画一点样点。 (2)点样 用毛细管取样，点在点样位置上，点样直径应小于2mm。若多次点样，则点一次，吹干一次。 (3)展开 将点好样的聚酰胺薄膜卷成圆筒形。样品则在筒内，箍以线圈固定。放在小层析槽内(可在小干燥器内置一培养皿代替)，槽内(培养皿)放人5-10ml展开溶剂工，进行展开，以溶剂前 沿到达距顶端0．5cm左右为止(约20min)。取出膜片，吹干。进行双向层析时，在第一向层析完毕，完全吹干(有时需晾过夜。才能充分吹干)，将聚酰胺薄膜片转90度，用展开溶剂Ⅱ展开。为了区分DNS-苏氨酸或者区分DNS-天门冬氨酸与DNS-谷氨酸，可在溶剂Ⅱ展开后，吹干，接着用溶剂Ⅲ沿同一个方向展开，只需展开至一半高度即可。为了区别乞εDNS-赖氨酸、α-DNS-组氨酸与DNS-精氨酸，应在溶剂Ⅱ中展开后，吹干，接着在溶剂Ⅳ中沿同一个方向展开。 (4)DNS，氨基酸的检测 展开结束后，取出薄膜，用电吹风机吹干，在360nn、或280nm的紫外灯下检测。DNS一氨基酸呈黄色荧光。此外还有其他颜色的杂点，如DNS-OH显绿色荧光等。用样品的层析谱与标准DNS一氨基酸层析谱相比较，可鉴别样品DNS-氨基酸的种类。 【思考】 1．薄膜层析与其他层析法比较有哪些优点？ 2．选用展层剂的依据是什么？ 实验九 动物基因组DNA的分离纯化 【目的和要求】 掌握盐溶法大量制备动物基因组DNA的基本原理和方法。 【实验原理】 根据核糖 …… |