医学免疫学实验技术

    医学免疫学是一门新兴学科，是生命科学发展的前沿领域。近20余年来，在分子生物学、细胞生物学、遗传学等多学科的渗透下，免疫学进展迅速，在理论、实验技术和临床应用等方面的发展日新月异。为了帮助学生理解和巩固所学的理论知识，开设实验教学是医学免疫学教学必不可少的重要环节。同时通过实验教学还可以培养学生的操作技能和分析问题、解决问题的能力及严谨的科学态度。
本书根据本科生医学免疫学的教学要求，分26个实验，介绍了体液免疫和细胞免疫体外检测的基本实验方法。通过这些实验，力求帮助学生更好地理解和掌握医学免疫这的基础理论、基本知识和基本技能。

    

    

实验一 玻片凝集反应
实验二 试管凝集反应
实验三 间接乳胶凝集反应
实验四 环状沉淀反应
实验五 单向琼脂扩散
实验六 双向琼脂扩散试验
实验七 对流免疫电泳
实验八 免疫电泳
实验九 火箭免疫电泳
实验十 免疫印迹
实验十一 补体结合反应
实验十二 血清总补体活性测定（CH50测定）
实验十三 深血空斑试验
实验十四 E花环形成试验
实验十五 淋巴细胞转化试验
实验十六 白细胞移动抑制试验
实验十七 酶联免疫吸附试验（ELISA）——间接法
实验十八 免疫荧光技术——间接法
实验十九 白细胞吞噬功能试验
实验二十 硝基兰四氮唑（NBT）试验
实验二十一 单克隆抗体检测T淋巴细胞亚群试验
实验二十二 免疫血清制备
实验二十三 免疫球蛋白（IgG）提取法
实验二十四 小鼠脾脏NK细胞活性测定
实验二十五 IL-2活性检测——MTT法
实验二十六 TNF活性检测——结晶紫掺入法
附录 常用试剂配制

实验十七 酶联免疫吸附试验
（ELISA）——间接法
酶标记免疫技术是一种免疫学检测方法。其原理是利用抗原抗体反应具有特异性，抗原或抗体吸附到固相载体表面，以及抗原抗体与酶连接后，仍保持免疫活性和酶活性，当酶遇到相应底物时，能催化其水解、氧化及还原等反应，生成有色产物。本法的特异性及灵敏度与荧光及同位素标记相似，但其方法较以上两者简便，且不需特殊贵重仪器。因此，这项技术目前正越来越广泛地被应用到医学的各个领域中。现以检测活动性结核患者血清中抗结核杆菌IgG抗体为例介绍ELISA间接法。
材料
1．聚合OT抗原（或PPD）。
2．待测病人血清、阳性及阴性对照血清。
3．辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG抗体。
4．O．05mol／L pH9．6碳酸盐缓冲液。
pH7．4吐温-磷酸盐缓冲液。
pH5．0磷酸盐．枸橼酸缓冲液。
邻苯二胺、30％双氧水、2mol／L硫酸。
5．聚苯乙烯微量塑料板。
方法
1．包被抗原：抗原用O．05mol\pH9．6碳酸盐缓冲液以最适浓度稀释后，加入聚苯乙烯微量塑料板孔中，每孔100tM，置37℃过夜。倒空包被液后用pH7．4吐温一磷酸盐缓冲液洗三次，每次3分钟。
2．加待检血清：用pH7．4吐温一磷酸盐缓冲液作1：100稀释，每孔加人100ul。每份标本加2孔，每板设阳性及阴性对照血清，阳性及阴性对照血清均按1：100稀释。置室温2小时（或37℃ 40分钟）后，倒空液体，用pH7．4吐温一磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟。
3．加酶联羊抗人IgG：每孔加入适当工作浓度的酶联羊抗人．IgGl00tA，置室温2小时（或37℃30分钟）。倒空液体后如上洗三次。
4．加底物：每孔加入新鲜配制的底物（100mlpH5．0磷酸盐-枸橼酸缓冲液加邻苯二40rag，30％H2O2 0．2ml）溶液100ul，放37℃显色数分钟，适时观察颜色的变化，最后每孔加一滴2mol几H，S04终止反应，肉眼观察或用酶标测定仪测定各孔光密度。
结果判断
肉眼观察，阴性血清无色或微黄色。阳性血清明显黄色。待测标本明显高于阴性而呈黄色则可判断阳性。如测定光密度。
结果判断
肉眼观察，阴性血清无色或微黄色。阳性血清明显黄色。待测标本明显高于阴性而呈黄色则可判断阳性。如测定光密度，待测样品光密度为阴性血清光密度值的2倍以上可判为阳性。
注意事项
1．包被液通常用pH9.6碳酸盐缓冲液，包被时间不少于18h，包被板一经洗涤，则不宜存放过长时间。
2．包被和温育均应将固相载体放至湿 ……